[0:00]Está mutada, Mari.
[0:04]Hola, buen día. Ahora sí, perdón el retraso. No te íbamos a escuchar nunca. No. Buen día. Capaz que en un rato. Yo traté como me dijiste Cami de usar el mail de la Facu, pero no me tomaba la contraseña, así que Buenas, buen día a todos, a todas. Hola Mari, Stefi, perdón, ayer no estuve, soy Cami. Esa fue la presentación. Ella es Cami Friedman, que hacer Les conté, no sé, probablemente algunos hayan sido alumnos. Ahí está saludando Maju, buen día. Che, faltan, ¿no? Porque son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Éramos 16, ¿no? Ajá. Eh, voy a hacer cuantificación a alguien que nunca me acuerdo cómo se hace, por supuesto. Pueden ir admitiendo. Dale, Marina, dale. Buen día. Buen día.
[1:16]Dale, perfecto.
[1:25]Listo, así pueden admitir. Bueno, voy a compartir la presentación.
[1:34]Voy a tratar de hacerlo breve, si hay dudas, eh lo vemos Lo vemos mañana y el viernes. 14 ahí. Concentrado. Vamos a compartir.
[2:52]Me olvidé de cambiar el, ahí está. Bueno, me van avisando. Ahora voy a sacar el modo este Así los veo bien. Van avisando si hay alguna duda.
[3:06]Como
[3:13]Como les, eh, comenté ayer, lo intenté en el WhatsApp, yo a veces escribo rápido, no se asusten si hay eñes, J, K, F, todo junto y que no se entiende, porque mis mensajes suelen no entenderse, se ve que mi predictivo no funciona o bolita de tan el bolita de tan loco, este a mi teléfono, que directamente mi predictivo no puede predecir las palabras, pero que pasamos por ahí, por otro lado, por otro lado. Eh, hoy vamos a ver lo que es el diseño del laboratorio de PC R, los controles y las contaminaciones. Este tema lo vamos a reforzar, eh, durante el día de mañana. Lo que es el ensayo uno, que es la PC R en tiempo real con curva de calibración utilizando CyberGreen, que es un intercalante, que es lo que Maju les contó ayer en la en la teórica breve que tuvieron, lo vamos a hacer mañana a la mañana. Entonces, ensayo uno, mañana a la mañana. A su vez, vamos a ver esta actividad de cuantificación, que cuadra perfecto con el ensayo que van a hacer, que es con curva de calibración. Para el lunes van a tener que subir al Drive el informe del ensayo uno. Y el lunes vamos a hacer la PC R en tiempo real, pero utilizando sondas, que es la modalidad Tagnam, y vamos a hacer la evaluación.
[4:41]Y esto lo tenemos que charlar. Yo el martes no puedo, pero si ustedes pueden el miércoles, sí, tendríamos la actividad virtual con el análisis de los resultados del taller y la discusión de situaciones problemáticas. Y el recuperatorio.
[5:00]A menos que mañana, cosa que no sé, nos dé el tiempo para ver esta parte. Así que todo va a quedar supeditado a cuánto podamos, eh, condensar de estas actividades mañana. Porque si mañana a mí me da el tiempo para explicar la actividad de cuantificación, que tampoco es tan larga, y analizar los resultados del taller y ver algunas situaciones problemáticas, lo que sería el miércoles 25 solamente quedaría para el recuperatorio. Todo depende de, vamos a ver mañana los tiempos. Bueno, yendo directamente a a lo que nos compete hoy. Cuando ustedes están en el laboratorio, van a recibir una muestra, que está ejemplificada como si fuese sangre entera o un medio de cultivo. La van a procesar por la metodología adecuada. Luego van a realizar la extracción de los ácidos nucleicos, es decir, ADN, ARN o ambos. Y van a eh realizar la técnica diagnóstica de PCR o RT-PCR, dependiendo del material de partida, si es ADN o ARN. Ahora bien, la PCR puede ser de punto final, para la cual, para poder visualizar el resultado, se tiene que realizar una electroforesis en gel de agarosa, como lo vimos en bioquímica, o puede ser una visualización en tiempo real mediante una PCR, mediante una PCR en tiempo real, que es lo que nos atañe en este taller. Entonces, como ven, tenemos toda una parte de recepción, procesamiento, extracción ácido nucleico, luego la etapa analítica y la etapa post analítica. Que, repito, la PCR en tiempo real, lo vemos, como lo dice la palabra, en tiempo real, en la de punto final, tenemos que abrir el tubito, sembrar en el gel y mirar el gel. ¿Cómo organizar los espacios y momentos de trabajo?
[6:57]Esto, claramente, esta diapo es de Maju, que es muy fan de Game of Thrones. Si se fijan, acá tenemos las contaminaciones y acá tenemos en esta foto divina lo que sería el RNA, simple cadena, y el DNA, doble cadena. ¿Qué equipamiento necesitamos para un laboratorio que hace QPCR? Una heladera o freezer para poder, eh, recibir y conservar las muestras. Freezer, ya sea de -20 o de -80.
[7:29]Centrífugas. Que puede ser refrigerada o no, dependiendo. Eh, un sistema de vacío, vórtice, baño seco, micropipetas, heladera, freezer, ultra freezer, espectrofotómetro, que generalmente para ácidos nucleicos uno lo que usa son estos espectrofotómetros que miden micro volúmenes, como dice el ejemplo del NanoDrop, que es la marca ThermoFisher, pero hay distintas marcas.
[7:58]Idealmente, a Thor, que es, eh, el robot de extracción, como el que tiene Maju en su laboratorio. Digamos, esto es lo ideal, porque uno me puede decir, bueno, para, yo no tengo baño seco. Bueno, okay, vemos otra alternativa. Eh, no sé, no tengo ultra freezer. Bueno, o sea, a veces es lo lo ideal y lo que uno cuenta en el laboratorio. Estamos viendo qué es lo ideal, cuál sería el material ideal que uno debería tener para poder hacer estos ensayos.
[8:28]El equipo de PCR en tiempo real, esto sí es irreemplazable, porque si no no puedo hacer PCR en tiempo real. Hay millones, bueno, millones no, soy muy exagerada. Eh, van a ver cuando yo doy clases, eh, los que fueron mis alumnos ya saben, porque todos me muero, soy muy exagerada, yo soy pisciana, así que van a ver que mis frases son así como catastróficas. Pero, eh, hay varias marcas de equipos. Nosotros en el laboratorio tenemos uno de Appley, que es el StepOne Plus. Maju, en su laboratorio, tiene de Biorad y tiene otros también que son de de Appley. Pero bueno, repito, hay distintas marcas. Cada uno con su cosas lindas y no tan lindas.
[9:07]Eh, mini centrífuga, vórtice, freezer, micropipetas de buena calidad y calibradas. Cuando uno trabaja en biología molecular y sobre todo en esta técnica de PCR, sobre todo la Q PCR, es imprescindible, les diría, que las pipetas estén calibradas. No se puede trabajar con pipetas que no estén calibradas, porque si no los ensayos tienen mucho error. Si voy a trabajar con una QPCR, sí o sí necesito computadora. No tengo computadora, puedo verlo igual. Sí. Van a ver que en el equipo del que está en el laboratorio hay dos. Hay uno, eh, que, eh, es de BioRad.
[9:47]Hay otro que es de la marca, no me acuerdo. No me pasé para acá y no quería pasarme.
[9:54]Que son los dos equipos que utilizamos en la unidad COVID. Eh, puede puede usarse sin estar acoplado a una computadora. Sí. La corrida, sobre todo en el de BioRad, la puedo ver en la pantallita que tiene el equipo. En el otro no lo puedo ver en el equipo, pero eventualmente puedo guardar la corrida en un pendrive y es el pendrive lo enchufó en mi computadora, que tiene cargado el programa, y ahí analizo la corrida. En ese equipo, yo les voy a mostrar los dos, uno lo que se estaría perdiendo es ver la corrida en tiempo real, si no tengo la computadora, este, acoplada, pero no es que no se pueda hacer la PCR. Y en el caso de la de la PCR de punto final, como les dije antes y como lo vimos en bioquímica, la visualización de la amplificación de los fragmentos, sí o sí la tengo que hacer mediante una electroforesis en gel de agarosa, utilizando algún tipo de intercalante, antes, hace muchos años atrás usábamos el famoso bromuro de Etidio. Hoy eso se reemplazó por otros intercalantes que no son tóxicos, como el CyberSafe, o bueno, hay varias marcas, eh, que me permiten visualizar al V eh, si hubo o no amplificación y obviamente comparo el tamaño de los fragmentos con un marcador de peso molecular. Entonces yo sé que este fragmento tiene un tamaño, por comparación con el ladder, de tanto y sé si la amplificación fue específica o no específica. En este caso, también necesito equipo de electroforesis, la fuente de poder, micropipetas, heladera, freezer para los reactivos. Dicho eso, una vez que hacemos PCR en tiempo real, no queremos más hacer esta, que siempre termina siendo un un dolor de cabeza, aunque muchas veces no nos queda otra, porque son complementarias. No, no es que se reemplazan. Contaminación. Uno, cuando habla de contaminación, eh, sobre todo cuando vamos, eh, a la de todo esto en bioquímica, uno dice, pero qué es contaminación ambiental, contaminación y uno piensa siempre en ser por qué en bacterias somos, ¿no? Acá de lo que estamos hablando de esa contaminación. Acá hablando de contaminación, cuando nos referimos a la introducción de ácidos nucleicos no deseados en la muestra. Y voy un poquito más a fondo, específicamente, a la introducción de ácidos nucleicos que yo estoy amplificando. Entonces, si yo tengo mi muestra contaminada con ácidos nucleicos que yo estoy queriendo amplificar y sí, obviamente, me va a dar positivo cuando en realidad la muestra no es positiva.
[12:12]¿Qué pasa? La PCR es una técnica extremadamente sensible. Ayer Maju lo explicó muy bien, que de una copia puedo obtener billones de copias. Es una amplificación exponencial y perfecta. Por ende, yo tengo una contaminación en el orden de los nanogramos y uno dice, importa, sí importa. Porque me va a dar un falso positivo. Entonces, hay que ser muy cuidadoso y por eso volvemos a la diapositiva anterior con el esquema de cómo organizar los espacios y los tiempos de trabajo. El otro problema es que la amplificación repetida de un mismo fragmento lleva a la acumulación de amplicónes, productos de la amplificación, en el ambiente del laboratorio. Me dicen, ¿cómo en el ambiente? En el aire. Increíble. Sí, en el aire.
[13:12]Queda en el aire. Queda en el aire y me contamina la muestra. O sea, el peligro de decir, bueno, hoy hago una PCR, pero perdón en los ejemplos, pero yo siempre nos referimos a virus, porque nosotros somos virólogas, es como el el más clásico. Entonces, hoy amplifico rotavirus. Mañana amplifico norovirus. Pasado amplifico hepatitis A. Claramente, al hacer distintas PCRs, si bien puede ocurrir la contaminación, de hecho ocurre, pero no me va a jorobar en las distintas PCRs. Ahora, tengo que amplificar, tengo que realizar la PCR para amplificar un fragmento específico de rotavirus en 500 muestras. Y la voy a hacer en 5 días repetidos y me van a llegar más muestras. Bueno, fíjense que estoy repitiendo la misma PCR todos los benditos días. Va a haber contaminación. Sí. Les aseguro que va a haber contaminación. En todos los lugares donde se ocurra. Entonces, esto es el tema de la repetición. Cuando yo repito la misma técnica, aumenta el riesgo de contaminación. Eh, los procedimientos de high-throughput favorecen las contaminaciones y, por supuesto, o sea, esto que les estoy comentando. ¿Cómo prevenir las contaminaciones? Las puedo prevenir. Sí. De hecho, uno las previene.
[14:25]¿Cómo? Un diseño exquisito del laboratorio y dinámica de trabajo. Que ahora vamos a ver cómo. El uso de equipos y materiales adecuados. Pipetas, tips con filtro, reactivos y descartables libres de DNAsas y RNAsas. EPPs. Manipulación de reactivos. Alícuotas. Almacenar los reactivos de PCR, enzimas, buffers, cebadores, dNTPs, agua y en alícuotas para minimizar los ciclos de congelación, descongelación y el riesgo de contaminación de los stocks principales.
[15:52]Ahí, ¿qué preguntaste de DNAsas y RNAsas? Son enzimas que van a degradar, como dijo Yanina, los ácidos nucleicos, ya sean ADN o ARN. Yo tengo que utilizar material libre de eso. Bien. Okay. Y a su vez, es un material que no esté reutilizado. Yo qué sé qué tuvo. Por eso mi cara ayer cuando vi que los Eppendorf no eran nuevos, porque tienen que estar muy bien lavados, que no haya presencia de inhibidores, como vamos a ver más adelante.
[16:40]Eh, lo ideal es que sean nuevos y que eh la etiquetita cuando los compro me diga, libre de DNasa y RNasa. Con respecto a la manipulación de los reactivos, lo que uno hace en el laboratorio, les diría de forma rutinaria es primero preparar, depende del reactivo, una solución madre, que es stock madre, que no toco. Llego, lo preparo, lo guardo y me olvido, prácticamente, que existe. Perdón, antes me olvidé, lo ideal es hacer alícuotas de ese reactivo, lo congelo y me olvido. Y después me preparo de uno de ellos una dilución de uso, y a partir de eso me voy haciendo distintas alícuotas. Cuestión, que si se me contaminó una alícuota, no se me contaminó el reactivo madre. Entonces, siempre puedo recurrir a ese. Imagínense que si yo no hago alícuotas, si yo hago un reactivo, lo resuspendo, lo congelo y voy trabajando siempre con ese. Una vez que lo contaminé, lo perdí. Y en biología molecular, los insumos son extremadamente costosos. Y además, ahora por suerte no tanto, pero muchas veces tardan. No sé, eh, la compra de una sonda de un primer, puede demorar más de dos meses. Entonces, si se me contaminó, yo frené todo por dos meses. Para que tengan dimensión. Entonces, alícuotas, hacer alícuotas, almacenar los reactivos de PCR, las enzimas, buffers, cebadores, dNTPs, agua y en alícuotas, por un lado, para minimizar el ciclo de congelación, descongelación y el riesgo de contaminación de los stocks principales.
[18:18]De hecho, en la actividad de ayer, ya te escucho Denise.
[18:24]De hecho, en la actividad de ayer, fíjense que en la tablita tenían el stock, eh, no sé si es stock madre o stock, no me acuerdo cómo es que decía, le espía, tendré que buscar qué tengo acá, y es pues tiene dilución de uso. Vieron que una era 100 micromolar y la otra eran 10 micromolar. Cuando yo me refiero a la madre, es esta 100 micromolar. Llega, resuspendo, alícuoto y me olvidé que existe. Denise, querías preguntar algo. O fue sin querer la mano.
[19:00]No.
[19:05]Bueno, cualquier cosa me avisan. Agua de grado molecular. No agua de la canilla ni agua destilada. Eventualmente agua Millicup, o sea, puedo utilizar que tiene que ser ultra pura, libre de nucleasas y de ADN y ARN humano. Por supuesto, reactivos de grado PCR, es decir, reactivos de alta calidad, certificados, como, o sea, uno ya hay muchas empresas a las cuales uno, este, las cuales uno trabaja, les diría, prácticamente de rutina. Vamos a lo que es el diseño del laboratorio y la dinámica de trabajo. Lo primero que uno hace es establecer lo que llamamos barreras mecánicas para prevenir contaminaciones. Cuando uno No, no hay problema, no hay problema. Yo vi la mano levantada y por eso pregunté. Eh, cuando uno habla de barreras mecánicas, literal, es para, eh, separar los distintos sectores. Fundamentalmente, lo que es preamplificación y postamplificación, porque la mayor contaminación se da luego de la amplificación, que es cuando generé estos millones de amplicónes.
[20:12]Idealmente, voy a tener cuatro áreas. Una primera área, que es donde se prepara la mezcla de reacción o mix de reacción. Otra área, que es la preparación de la muestra en sí y de los controles, lo cual incluye el procesamiento muchas veces de la muestra. Otra área, que es netamente el área de amplificación. Y otra área, que es la visualización del producto de amplificación en el caso de la PCR de punto final. ¿Por qué no en el caso de la PCR en tiempo real? Porque lo estoy viendo en tiempo real en la computadora. No necesito abrir el tubito, sembrarlo en un gel. Entonces, esta área, el área cuatro, fundamentalmente es cuando hago PCR de punto final. Y lo otro, súper importante, es que siempre haya una única dirección en esto que acabo de mencionar. Este flujo unidireccional va a aplicar para las personas, para los operadores y para todos los materiales. Desde la zona libre de amplificados, que la vamos a llamar zona limpia, a la zona donde se amplificaron los productos, que es la zona sucia. Retirar, obviamente, todos los elementos de protección personal, guardapolvo, guantes, eventualmente lentes, no sé, lentes, etc., de una zona a la otra.
[21:37]Evitar, o sea, no es evitar, es no realizar el flujo inverso. A veces alguien me va a decir, y ahora voy a dar un par de ejemplos, no me queda otra. Bueno, tendré que tomar más recaudos. Los materiales reutilizables se tienen que descontaminar antes de volver a la zona limpia. Eh, esto también es fantástico, ¿no?
[21:56]Uno dice, che, escúchame, estoy en la zona limpia, me quedé sin tips. Listo, ya está, me morí, porque no puedo entrar nada. No, bueno, sí, si yo tengo la cajita nueva de tips, que está en el sector guardado adecuado, o eventualmente es algo autoclavado y ya está descontaminado, por supuesto que puedo volver a ingresar. De hecho, la persona que amplificó, en algún momento tiene que volver a ingresar a la zona limpia. Pero lo importante es no ir de una zona a la otra con materiales de una zona a la otra, intercambiándose, cosa que hemos visto en muchísimos laboratorios. Yo cito mucho, cuando, eh, hacíamos diagnóstico de COVID en la Universidad con Maju, eh, y con Cami, que teníamos una organización muy prolija de los espacios y de la dinámica de trabajo, porque claro, venían 500 muestras. 500 muestras, uno tenía que informarle el resultado al paciente positivo o negativo.
[22:51]Y acorde a eso era, te aíslan, no te aíslan, puedes ir al cumpleaños, no puedes ir al cumpleaños, o sea, pones a a tu viejo, o sea, en riesgo, o sea, cosas graves y mucho más graves, no podíamos equivocarnos. No podíamos darnos el lujo de tener una contaminación. Y lo pongo porque fue en un momento de mucho trabajo, en el cual, eh, muchas veces nos íbamos a las 10 de la noche y no podía haber errores. Entonces, el poder trabajar bien, prolijo y con la certeza de que el resultado que uno está informando es verdadero y no es una contaminación, implica esto. Desde el diseño, la temporalidad, la unidireccionalidad del flujo y controles que vamos a ver más adelante. Ideal, poca gente dando vueltas. A veces, además, mucha gente dando vueltas es molesto. Así que, sí, esto, desde ya.
[23:41]Y acá, este es uno de los diseños que a mí más me gusta. No sé por qué se me fue el puntero. Ahora lo tengo. Eh, fíjense, tenemos una zona de preparación de los reactivos y mix de PCR.
[24:02]PCR o QPCR, esto aplica para cualquiera de las dos, PCR en tiempo real o PCR de punto final. Después les voy a mostrar fotos. Me olvidé de subir las nuestras, pero, eh, se las muestro mañana en el en el taller. Pero van a haber fotos con este trabajando de cómo lo tiene Maju organizado en su laboratorio. Entonces, un cuarto o un espacio, vamos a llamar de preparación de reactivos y mix de PCR. Luego un espacio donde uno prepara la muestra. Miren el flujo. ¿Qué hago primero? Esto. Y luego esto. Pero me llegó la muestra. Bueno, okay, almacena, la guarda en el freezer, la heladera. Y primero preparas la mix. Pero tengo que largar 100 PCRs. Bueno, la carga es toda las mix de todas las PCRs que vas a hacer en el día, primero, y después tocas la muestra. Y tocas la muestra y me olvidé de largar una PCR. Puedes volver para atrás. No.
[25:02]No.
[25:05]No, y alguien me dice, sí, pero escúchame, necesitamos el resultado en el día. Si no queda otra, bueno, tendré que tomar todas las precauciones habidas y por haber. Entre ellos, lo que les comenté, del equipo de protección personal, que el de acá es exclusivo de acá y el de acá es exclusivo de acá y nunca se mezclan. Y si no me queda otra más que volver, como nos ha pasado en el laboratorio de de diagnóstico de COVID, como dije antes, bueno, si no me queda otra y lo tengo que hacer, no sé, me pondré doble guantes, usaré cofia, me pondré lentes. Por supuesto, no mezclo elementos de protección personal y la largaré. Pero antes de hacer eso, voy a agotado otras medidas. Ejemplo, hay alguien más que pueda largar la mix que no haya tenido contacto con la muestra. Entonces, si eso sucede, bueno, que la largue otra persona. Por eso, unidireccionalidad en el flujo. Luego la amplificación propiamente dicha. Acá largó la PCR y finalmente la detección y análisis de resultados. Repito, en el caso de la PCR en tiempo real, simplemente voy mirando la computadora, no toco tubito, no abro tubito, no hay no hay riesgo de, eh, digamos, contaminación post amplificación por apertura de Ependorf. En la de punto final, sí, y de hecho, aún así, una vez, ay, yo largué la PCR. Miré el el la amplificación. Ya saqué los strips del equipo. Puedo largar otra mix.
[26:29]No. Una vez que amplifico, no vuelvo. Ven las líneas rojas y las negras para mí. Fíjense, desde la no amplificación hasta los obtención de los amplicónes en productos de amplificación. De todas las que le voy a mostrar, este es el diseño que más me gusta. Ahora van a ver, que hay otros diseños donde hay y acá cada laboratorio lo va adaptando. Donde lo que sí se va a respetar siempre es zona limpia y zona sucia. La zona limpia es donde no hay amplificación y donde uno prepara los reactivos para poder realizar la reacción de PCR. A partir de ahí, arranca la zona incrementándose en suciedad, por decirlo así, desde lo que es preparación de muestra y controles y la zona más sucia que es la amplificación. Y fíjense que el flujo siempre unidireccional, desde la zona limpia, hacia la hacia la zona sucia. Ludmila, ¿levantaste la mano? Sí, profe, eh basándome en el laburo que estuvimos ayer, que es muy chico, teniendo en cuenta esto de la zona limpia, zona sucia, nos vamos a cambiar de laboratorio, imagino, ¿no? Amo tu pregunta, porque vos sabes que antes de venir al laboratorio fue lo que hablábamos con Maju. No, es perfecta. Mañana no nos podemos cambiar de laboratorio. Voy a intentar, lo justo ayer hablábamos de eso, Maju, porque el ideal sería que largáramos la mix de PCR en otro laboratorio, con otras pipetas. Y todo lo que es el toqueteo de la curva de calibración y la carga en los strips y y colocar en el equipo, no sé. Incluso alguna de ThermoFisher, que se conserva -20, pero puede variar entre marcas. Esto en realidad es como un tip general cuando uno trabaja en el laboratorio. Cuando uno la laboratorio tiene que usar un reactivo, o lleva un reactivo, lo primero que hago es lo miro, miro la etiqueta de lo que es el MSD, es el material safety sheet, o sea, la hoja de seguridad.
