[0:00]Bonjour, je vous présente une vidéo sur le principe de l'HPLC. Que signifie HPLC ? En anglais, cela signifie High Performance Liquid Chromatography. Et historiquement, cela signifie le P signifie pressure. Vous voyez ici un appareil à chromatographie et on distingue assez mal les éléments qui le composent. En tous les cas, il y aura toujours une colonne, la fameuse colonne qui sert en chromatographie pour séparer les composés qui contient la phase fixe. Cette colonne peut être petite ou grande et bien souvent, elle est cachée, on ne la voit pas. Analysons les phases fixes et mobiles en HPLC. Donc, comme en chromatographie classique, la colonne est remplie de phase fixe qui sont des petits grains. Et la phase mobile s'écoule depuis le haut de la colonne vers le bas de la colonne. Mais en HPLC, on ne la verse pas manuellement. Elle est versée automatiquement, on verra à l'aide d'une pompe. En HPLC, on peut utiliser tout type de chromatographie: partage, adsorption, échange d'ions. Et dans les chromatographies de partage, on distingue, nous l'avons déjà vu, les phases normales, c'est-à-dire que la phase fixe est plus polaire que la phase mobile, ou bien, on peut se placer en phase inverse, c'est-à-dire que la phase fixe est plus apolaire que la phase mobile. Pourquoi utilise-t-on une haute pression dans le but d'avoir une haute performance en HPLC ? Nous allons voir sur cette figure que plus les grains sont petits de la phase fixe, et plus la surface de contact entre les deux phases est élevée. Donc, mieux se fera la séparation des composés entre ces deux phases. Donc, imaginons donc une phase fixe à l'intérieur d'une colonne et on zoom sur un grain de cette phase fixe. Et voici donc le contact phase mobile, phase fixe, au niveau de ce grain. Si la taille de ce grain est plus petite, autrement dit, la granulométrie est plus faible. On voit bien que la surface entre la phase mobile qui traverse ces grains et la phase fixe est plus importante. Recommençons avec des grains encore plus petits. Là aussi, le contact entre les deux phases sera beaucoup plus efficace que dans le cas où le grain était très gros. Donc la granulométrie, c'est-à-dire la taille des grains de la phase fixe influe sur la qualité de séparation de des composés à l'intérieur de cette phase fixe, bien sûr, en présence de la phase mobile. Donc, lorsque les grains sont fins, et bien la résolution, c'est-à-dire la séparation des composés, donc finalement la séparation des pics des de ces composés au niveau du chromatogramme n'est pas très bonne. Lorsque les grains sont très fins, on voit que les pics se séparent davantage et lorsque les grains sont très très fins, et bien, on voit que les pics sont fins et écartés. C'est cela qui permet de voir que la résolution, c'est-à-dire la qualité de la séparation des composés est efficace. Donc, plus la granulométrie diminue, plus la résolution de la technique augmente. Et donc, on voit bien que la performance est d'autant plus élevée visiblement que la granulométrie, comme nous venons de voir, est petite. Oui, mais quand les grains sont fins, on voit bien que le liquide passera beaucoup mieux que lorsque les grains sont très fins et encore beaucoup mieux que lorsque les grains sont très très fins. Donc on voit bien que cette phase mobile ne circulera dans la phase fixe que si on doit imposer une certaine pression de plus en plus forte si les grains sont très fins. Il faut imaginer un peu comme le café, on voit bien que quand le café est moulu très fin et très serré, et bien si on n'ajoute pas une pression pour faire couler l'eau à travers ces grains de café moulu, jamais on a un café dans les temps voulus. Donc, plus la granulométrie diminue, plus la résolution augmente, c'est vrai, mais mieux, mais plus il faudra utiliser une pression élevée. Donc, voici un appareillage HPLC et pour que cet appareillage résiste aux hautes pressions, et bien on verra que de nombreuses pièces et même toutes les tuyauteries sont en acier inoxydable et non plus en plastique pour supporter cette haute pression. Regardons maintenant la composition de l'appareil HPLC dont vous voyez une photo sur la droite de l'écran. Certains appareils sont capables de mélanger plusieurs liquides pour composer la phase mobile. Donc ici, voilà deux flacons. Qui sont aspirés chacun d'eux par une pompe pour créer une certaine pression. Et donc certains appareils ont la capacité de créer un mélange à partir de plusieurs flacons. Et puis après la pompe, il y a un système d'injection, c'est-à-dire c'est là à l'intérieur de ce système que l'on viendra déposer l'échantillon contenant les molécules à séparer. Bien sûr, juste après cela, on trouve la colonne remplie de phase fixe. Au-delà de la colonne, un appareillage pour détecter de manière très spécifique les composés à séparer. Imaginons que ce soient des molécules qui absorbent à 280 nanomètres telles que les protéines, et bien le détecteur est un spectrophotomètre réglé sur 280 nanomètres. Après le détecteur, le liquide part dans une poubelle. Mais bien sûr, ce détecteur envoie les informations qu'il a relevées vers un système d'analyseur et donc apparaît à l'écran un chromatogramme. Donc attention, le liquide circule depuis les flacons, la pompe, le système d'injection, la colonne jusqu'au détecteur et jusque dans la poubelle. Entre le détecteur et l'analyseur, bien sûr, c'est un système numérique qui permet de transmettre les informations. Regardons maintenant plus en détail la partie injecteur. Cet injecteur est composé de ce qu'on appelle une vanne rhéodyne. Cette vanne rhéodyne est remplie à l'aide d'une seringue comme est indiqué sur le sur ce schéma et vous voyez qu'à l'arrière de cette vanne, on voit une boucle dont le volume est indiqué ici 20 microlitres. C'est cette boucle qui définit le volume d'injection, c'est-à-dire que la seringue permettra de remplir cette boucle et on ne cherche pas à prélever exactement 20 microlitres avec la seringue. On va comprendre pourquoi. Donc, si on regarde l'intérieur de cette vanne rhéodyne, et bien voilà le système. Tout d'abord, j'affiche ici le circuit qui vient comme on vient de le voir de la de la pompe et qui va, bien sûr, vers la colonne. On est entre les deux puisqu'on est au niveau du système d'injection. Lorsqu'on remplit la boucle, le la boucle est au départ déconnectée du circuit. Vous voyez qu'ici je le fais en vert. Donc, le la partie boucle est remplie avec l'échantillon. Et pour l'instant, cette boucle, le contenu de la boucle n'est pas du tout connecté au circuit de liquide de phase mobile qui va vers la colonne. Dans un deuxième temps, lorsque l'on bascule la la vanne, et bien, on connecte le circuit avec la boucle. Et du coup, l'ensemble du du contenu de la boucle est emporté dans le circuit et donc vers la colonne. Quel est l'intérêt de ça ? Et bien c'est que du coup, lorsqu'on injecte le liquide, on ne crée pas de surpression. Cette pompe que le qui est là pour imprimer une pression à l'ensemble du système, doit permettre d'avoir une une pression très stable. Donc, il ne faut pas que lorsque l'on injecte, on fasse varier cette pression. Je vous invite à regarder comment se déroule une injection à partir de cette petite vidéo qui a été faite au lycée Valin. Voici donc très rapidement la procédure d'injection. Donc on remplit la seringue avec l'échantillon à analyser. Attention de ne pas inspirer de bulle et vous voyez qu'on rejette les éventuelles bulles sur un petit papier. Puis on insère la seringue de façon bien horizontale à l'intérieur de la vendine jusqu'à ce qu'on sente le joint au bout. Puis, on pousse petit à petit le piston pour remplir la boucle au bout. Donc, le trop-plein s'écoule à l'arrière et vous voyez, tac, on lance l'injection en actionnant la vanne réodyne. C'est le temps zéro. Essayons de comprendre comment est identifié un composé à partir d'un chromatogramme. Le premier chromatogramme qui s'affiche ne montre qu'un seul pic. On voit que ce pic apparaît pour le temps de rétention ou temps d'élution 3 minutes 165. Si l'on réalise dans la même colonne, dans les mêmes conditions opératoires, donc même phase mobile et même phase fixe, une autre séparation à partir d'un mélange complexe. Et que dans ce mélange complexe se trouve le composé qui avait été analysé dans le premier chromatogramme, et bien ce composé sortira exactement au même temps de rétention que dans le premier chromatogramme.
[10:17]Donc, pour identifier un composé à l'intérieur d'un chromatogramme par un pic donné, il suffit de comparer les temps de rétention avec des chromatogrammes étalons pour lequel on connaît les molécules qui traversent la colonne et dont on repère le temps de rétention. Donc, c'est deux temps de rétention étant équivalents, c'est que ce composé correspond à ce composé étalon que j'avais repéré auparavant. Maintenant, comment je procède pour quantifier un composé à partir du pic qui lui correspond ? Toujours pareil, ce temps de rétention que l'on observe à 3,165 minutes correspond à un composé donné. Si je mesure et plus exactement à l'aide de l'appareil de l'ordinateur qui calcule la surface de l'air ou encore de du pic ou encore l'air du pic, et bien je peux comparer cette air avec l'air, mais de ce même composé, c'est-à-dire celui qui a le temps de rétention de 3,165. Donc, si l'air de ce composé dans le chromatogramme 2 est deux fois plus grande que l'air de ce même composé dans le chromatogramme 1, et que je connais la concentration du composé dans le chromatogramme 1, alors ça veut dire que la concentration du composé dans le chromatogramme 2 est deux fois plus élevée. Autrement dit, je peux écrire que l'air d'un composé est et une constante fois le nombre de moles qui qui ont été injectées dans la colonne ou encore 4 fois c fois le volume injecté. Donc je peux me servir de la surface du pic d'un étalon. R de l'étalon d'un composé X = k fois la concentration fois le volume injecté. Donc l'air de ce même composé X dans un échantillon complexe est égal au K qui est le même, le K du composé X fois la concentration de cet échantillon, fois le volume injecté de ce composé X. Et donc, je peux facilement en déduire que la concentration du composé X est égale à l'air de l'échantillon fois la concentration de l'échantillon sur l'air de l'étalon. Alors, ai-je le droit de comparer l'air de deux composés différents ? Autrement dit, l'air du pic d'un composé 3 avec l'air du pic d'un composé 2. Donc, si ces deux composés ne sont pas identiques, je n'ai pas le droit d'appliquer la règle que je viens d'appliquer. Donc il faut que j'utilise un chromatogramme dans lequel je connais la concentration du composé 3 pour pouvoir déterminer la concentration du composé 3 dans un chromatogramme dans lequel je veux le quantifier. Donc, j'ai pas le droit d'appliquer cette règle. Non.
[12:41]Voici maintenant un petit casse-tête. Imaginons que l'on soit en chromatographie de partage, autrement dit, la phase fixe choisie permet de réaliser une une chromatographie de partage. Et on choisit d'être en phase normale, c'est-à-dire que la phase fixe est, je vous laisse réfléchir un peu, la phase fixe est plus. Oui, plus polaire que la phase mobile. Et donc la question est la suivante: vrai ou faux ? Parmi les quatre composés qui sont ici sur ce chromatogramme, est-ce que c'est le composé le plus apolaire qui sort en premier ? Je vous laisse réfléchir avant de donner la réponse, donc mettez sur pause. Et bien, réfléchissons. Si la phase fixe est polaire et que la phase mobile est apolaire. Je vous rappelle que quand on est en chromatographie de partage, il y a deux forces, une de rétention donc qui s'exerce entre chaque composé et la phase fixe, une d'entraînement qui s'exerce entre chaque composé et la phase mobile. Et cette force est due à la solubilité des composés dans chacune des phases. Donc, le composé qui sort le plus rapidement est celui qui est le plus soluble dans la phase mobile, qui elle-même est plus apolaire que la phase fixe. Un composé soluble dans une phase apolaire est donc le plus apolaire. Donc, celui qui sort le plus rapidement est le composé le plus apolaire, puis le deuxième composé sera le plus apolaire restant, et cetera jusqu'au plus polaire parmi ces quatre composés. Un petit quiz maintenant pour terminer. Citer les éléments composant un appareillage HPLC. Réfléchissez avant de passer à la suite. Question 2, expliciter le sigle HPLC. Troisième question: expliquer l'intérêt d'utiliser une phase fixe de faible granulométrie. Comment quantifier un composé repéré par un pic d'élution ?
[15:10]Comment choisit-on le type de détecteur placé après la colonne ? Réfléchissez bien à toutes ces questions avant de terminer. Je vous remercie de votre attention.
