[0:02]En este momento, repasaremos el tema de electroforesis y su utilidad en el análisis de ácidos nucleicos. La electroforesis se define formalmente como el movimiento o dispersión de partículas tras ser sometidas a un campo eléctrico. Generalmente se realiza en una matriz o gel y suele utilizarse para separar moléculas con base en su tamaño. En el caso particular del DNA, tenemos grupos fosfato, los cuales le otorgan una carga negativa a la molécula. Dado que por cada base nitrogenada tendremos un grupo fosfato, la relación masa carga siempre se va a conservar, por lo que la movilidad electroforética será siempre la misma. Por tanto, se pueden separar las cadenas en una matriz que disminuye la movilidad en función de sus tamaños. Existen varios sistemas de electroforesis aplicados a los ácidos nucleicos, pero estos son los principales.
[1:03]En la electroforesis en gel la garosa, usamos este polisacárido natural proveniente de las algas. Este tipo de electroforesis es útil para separar cadenas de un tamaño pequeño hasta un rango de kilobases. Estos geles suelen correrse de manera horizontal y con buffers de corrida como TA o TBE. La electroforesis en gel de poliacrilamida se utiliza principalmente para la separación de proteínas. Sin embargo, también es útil para la separación de ácidos nucleicos de menor tamaño y con una mayor resolución. Para formar el gel, la acrilamida entra en una reacción de polimerización con la bisacrilamida, la cual es iniciada tras la presencia de persulfato de amonio y de la molécula temed. Lo cual permite formar un polímero más estrecho que los obtenidos por agarosa. Estos geles suelen ser verticales para evitar contacto superficial con el oxígeno y evitar la inhibición de la polimerización. En ambos tipos de sistemas, se suelen tener geles con pozos en los cuales se pipetea una serie de muestras. Casi siempre se suele pipetear en un pozo un estándar con diferentes fragmentos con un número de pares de bases conocidos. A este le llamamos peso molecular. En las bandas de las muestras obtenidas se comparan con el peso molecular. En ocasiones, y especialmente tras una restricción enzimática, podemos tener varias bandas en un mismo pozo. Esto es común cuando se hace ensayos de genotipificación o tras digerir un plásmido. Para poder observar a simple vista las bandas de DNA, el gel se tiñe con bromuro de etidio, un químico que se intercala en el DNA y fluoresce en presencia de luz ultravioleta.
[2:46]Existen otros sistemas electroforéticos además de estos. Uno de ellos es la electroforesis de campos pulsados. En ocasiones, cuando se busca trabajar con fragmentos con un tamaño de megabases, el uso de un gel de agarosa convencional no resulta práctico. En la versión más común de campos pulsados, el voltaje se cambia en tres diferentes direcciones, haciendo que las grandes cadenas se puedan definir mejor. Además de la matriz de agarosa usada, las moléculas giran de un lado a otro. Las cadenas más largas tardarán más en cambiar de una dirección de un campo eléctrico a la dirección de otro campo, mientras que las cadenas más cortas tendrán menos dificultades. En este tipo de electroforesis se pueden trabajar cromosomas bacterianos digeridos, por lo que es sumamente útil para el campo de la infectología. Aquí se hacen dendrogramas para ver qué tanto cambia un patrón de restricción de un genoma bacteriano, lo cual está correlacionado a qué tanto muta esta bacteria en particular. En la electroforesis de gradiente desnaturalizante hacemos uso de un gel con un gradiente de urea y formamida dentro del mismo sistema. Este gradiente es capaz de desnaturalizar las cadenas de DNA y hacerlas monocatenarias. El principio de esta electroforesis consiste en que, mientras más desnaturalizado esté una cadena de DNA, menos migración electroforética existirá. El gradiente puede ser perpendicular al campo eléctrico. En este tipo de geles se suele tener un solo pozo donde se coloca un par de muestras y se suele obtener esta sigmoide. En la parte izquierda, donde hay una mayor migración, podemos encontrar cadenas de DNA casi completamente unidas. En la parte del centro, tendremos una cadena parcialmente desnaturalizada y en la parte de menor migración, cadenas de DNA monocatenarias. En esta electroforesis se puede observar la presencia de mutaciones o genes únicos, dado que el cambio de hasta solo una base puede cambiar las propiedades físico-químicas de las cadenas, dando como resultado una sigmoide diferente. La direccionalidad también puede ser paralela al campo eléctrico. En este caso y bajo el mismo principio, se pueden analizar genes compartidos y genes únicos. Estos geles resultan muy útiles para analizar la información genética de diversas comunidades bacterianas. La electroforesis capilar consiste en pasar el sistema a un pequeño capilar de sílice. Este se puede someter a un campo eléctrico para separar diversas moléculas, las cuales pueden estar en concentraciones sumamente pequeñas. Generalmente se utiliza un detector, el cual tomará datos en un electroferograma, cada vez que pase una molécula de DNA marcada con algún fluoróforo específico. Esta electroforesis suele ser muy útil para la secuenciación Sanger.
