[0:00]Saludos, estimados estudiantes, continuando con el avance de nuestro curso de análisis instrumental, en esta ocasión vamos a conversar sobre las aplicaciones de la espectroscopía ultravioleta visible en el análisis cuantitativo. De hecho, la técnica de espectroscopía ultravioleta visible se utiliza ampliamente con el fin de establecer la concentración de un analito en una muestra. Esto se debe a que existen muchas moléculas capaces de absorber energía en la región del ultravioleta visible y esta magnitud de la absorción, traducida como absorbancia o porcentaje de transmitancia, es directamente proporcional a la concentración. El fármaco que estamos viendo en el lado derecho de esta diapositiva es la tolbutamina, un principio activo utilizado en el tratamiento de diabetes y debido a la presencia de anillos bencénicos y de dobles enlaces, esta molécula es capaz de absorber energía en la región del ultravioleta. A pesar de ser incolora, cumple con la ley de Beer y se puede cuantificar mediante técnicas de espectroscopía ultravioleta visible. En cambio, toda sustancia coloreada puede ser susceptible de cuantificación en la región del visible. De hecho, aquí estamos viendo nosotros una serie de soluciones de ion nitrato, ¿sí?, en las cuales se ha hecho un desarrollo de color. Y obviamente se ve que a medida que aumenta la concentración de el ion nitrato en las en las soluciones, se incrementa la intensidad del color. Por consiguiente, este tipo de sets de soluciones nos sirven para poder establecer modelos lineales, los cuales permiten hacer curvas de calibración y así cuantificar la presencia de un analito en una muestra. En esta diapositiva nosotros vemos todo el espectro ultravioleta visible, ¿sí?, y el comportamiento del mismo ante el ojo humano, que es el primer detector, digamos así, de intensidad de absorción. Por ejemplo, en la región del ultravioleta que va de 180 a 380 nanómetros, nosotros no podemos percibir colores. Todas las sustancias, todos los analitos que absorben en la región del ultravioleta son incoloros. En cambio, la región del visible, ¿sí?, se da lo que se conoce como teoría del color complementario. Las moléculas que se observan coloreadas, se debe a que están absorbiendo una región del espectro en la región del visible y transmitiendo otra región que es la que nosotros percibimos como color, ¿sí? Entonces, vemos por ejemplo, que si un analito tiene un máximo de absorción entre 400 y 435 nanómetros, nosotros lo vamos a observar de color amarillo verdoso, pero la región que está absorbiendo corresponde a la del color violeta, ¿sí? De hecho, ustedes recordarán, cuando nosotros trabajamos en el laboratorio, las soluciones de sulfato de cobre, tienen color verde azulado, esa es la que nosotros observamos, pero la región que absorben corresponde a la región del rojo, que es la de mayor longitud de onda de 650 a 750 nanómetros. Entonces, aquí al lado derecho tenemos la rueda del color, donde justamente los colores opuestos son colores complementarios. Si se absorbe en la región del rojo, se observa la la solución de coloración verde azulada, ¿okay? Entonces, basándonos en estos principios, en el hecho de que la magnitud de la absorción es directamente proporcional a la concentración, podemos establecer métodos de calibración, ¿sí? Podemos relacionar la intensidad de la señal analítica que puede ser absorbancia o transmitancia, con la concentración de nuestro analito. El procedimiento generalmente implica establecer la longitud de onda de nuestro analito, sea mediante barrido espectral o con una técnica ya establecida nos va a decir exactamente a qué longitud de onda trabajar. Evidentemente tenemos que verificar que existe el cumplimiento de la ley de Beer, tenemos que verificar que la concentración sea directamente proporcional a la absorbancia y además tenemos que trabajar en el rango de concentración donde se cumpla esta relación, la ley de Beer, para evitar justamente la presencia de errores, como nosotros ya lo vimos en la clase pasada, ¿verdad? Nosotros ya sabemos que toda solución que se someta a este tipo de trabajo debe tener una concentración menor a 0.03 molar. Tenemos diferentes métodos de para establecer calibraciones. En esta ocasión vamos a analizar dos. El primero va a ser la calibración con estándares externos. Qué buscamos con este método? Establecer la relación entre la absorbancia y la concentración de un analito a una longitud de onda específica, que debe ser obviamente la de absorción de nuestro analito. Para esto, nosotros debemos preparar una serie de soluciones que se llaman estándares o patrones, ¿sí?, que tienen nuestro analito en concentraciones crecientes. Normalmente se recomienda utilizar de cinco a seis patrones, ¿por qué razón? Porque si utilizamos dos, entre dos puntos siempre va a pasar una línea recta. Si utilizamos tres, vamos a tener obviamente un punto que tiene un comportamiento dudoso. Cuatro también nos da una gran incertidumbre, así que se se debe hacer una curva de calibración con mínimo cinco en adelante soluciones estándares. Además, tenemos que preparar un blanco. Un blanco es una solución que tiene todos los componentes de los estándares, excepto el analito, es decir, va a tener el mismo solvente. Si hemos controlado el pH, va a tener la misma solución con la cual se controla el pH y lo único que no se tiene es el analito. ¿Por qué razón? Porque en el solvente o en los reactivos que hemos adicionado al medio, puede ser, es posible que exista alguna sustancia capaz de absorber energía a la misma longitud de onda que el analito. Entonces, vamos a hacer una corrección haciendo este blanco y midiendo la absorbancia del blanco y restando esta absorbancia de las que generen los estándares. Y al final tenemos una muestra que también se prepara con el mismo solvente y con el mismo tratamiento que los estándares.
[7:11]Entonces, al tener este tipo de soluciones más el blanco, vamos al equipo, vamos al espectrofotómetro y medimos la absorbancia, la longitud de onda correspondiente, ¿sí?, con el incremento de concentraciones, vamos a tener también que la absorbancia se incrementa. Y de este modo podemos establecer un modelo lineal. Antiguamente lo que se hacía era graficar en un papel milimetrado la concentración versus la absorbancia y simplemente nosotros medíamos la absorbancia de nuestra muestra en el equipo y la interpolábamos a la, en el gráfico, ¿no es cierto?, al eje de las X, que es el eje de la concentración. Pero evidentemente esto da un gran espacio a error, así que lo más adecuado es hacer una regresión lineal por mínimos cuadrados, ¿sí? Incluso podemos obtener un coeficiente de correlación, que mientras más cercano a la unidad, significa que nuestro modelo responde a la a la relación concentración directamente proporcional a la absorbancia, ¿sí? Y luego evidentemente, despejamos la concentración de esta expresión y podemos calcular con la absorbancia de la muestra, la concentración de la misma, que aquí resulta ser 6.80 miligramos por litro. Existe otro método que tiene algunas situaciones interesantes, que es el método de adición de estándares. Se preguntarán qué hace Keanu Reeves por aquí. Justamente se debe a que la bondad que tiene este método es que se puede superar o se puede subsanar el llamado efecto matriz. Qué es el efecto matriz? El efecto matriz se da cuando la muestra tiene una gran complejidad. Por ejemplo, si es que yo estoy trabajando con un alimento, vamos a suponer que estoy trabajando con una bebida que se utiliza para hidratación, las famosas bebidas que se consumen por los deportistas. Y yo quiero saber la cantidad de colorante que tiene esta bebida de un colorante rojo, yo lo que podría hacer es darme el trabajo de extraer el colorante de la bebida y hacer la cuantificación, o simplemente tomar la bebida tal cual con todos los otros componentes, que son las sales de hidratación, el el edulcorante, los preservantes, etcétera, ¿no es cierto?, y hacer la cuantificación de rojo 40 sin necesidad de un tratamiento adicional de la muestra. Es decir, la matriz son los otros componentes que tiene la muestra, además del analito, ¿sí? Otros ejemplos de matrices complejas son, por ejemplo, las aguas residuales, porque van a tener otros otros componentes, impurezas o cationes, etcétera, ¿no es cierto? O también puede ser una matriz la una una muestra problema que tenga que sea desconocida, de la cual yo tenga poca información sobre la muestra. La ventaja importante de este método, justamente es que permite obtener resultados confiables tratando la muestra como tal, sin retirar interferencias. Y las desventajas es que si es que yo tengo una gran cantidad de muestras, voy a tener que hacer una curva de calibración por cada muestra, ¿sí? Entonces, ¿cómo trabajamos en el método de adición de estándar? Como ya dijimos, el número recomendable de balones volumétricos, digamos así, para preparar nuestra set de estándares es de cinco en adelante. En este ejemplo, yo he decidido hacer con cinco balones volumétricos, a cada uno de ellos, voy a voy a colocar un volumen fijo de la muestra sin tratarle previamente. Por ejemplo, retomando el ejemplo de la bebida deportiva, yo voy a colocar 5 mililitros, por ejemplo, voy a dar un número 5 mililitros de la bebida con el colorante rojo 40 en cada uno de los balones. El mismo volumen, ¿sí? Y aquí lo que voy a hacer es colocar volúmenes crecientes de una solución, en cambio, que tenga solamente el colorante rojo 40, ¿sí? Esta solución va a ser mi estándar, ¿sí?, y esta va a tener que ser de una concentración conocida, por ejemplo, de 10 PPM. Voy a colocar 2, 4, 6, 8 y 10 mL de una concentración conocida de rojo 40, ¿sí? Luego procederé a forrar, a homogeneizar, ¿no es cierto?, y a leer la absorbancia a la longitud de onda correspondiente. Ahora, aquí está el punto donde se diferencia el método de adición de estándar del método de calibración con estándar externo. Tenemos que calcular una ecuación de la recta, pero aquí la variable X va a ser el volumen de estándar adicionado, ¿sí? Es decir, cuánta cantidad de estándar adicioné en los balones y la variable Y será la absorbancia. Por consiguiente, de esta relación, yo voy a obtener una recta y de esta recta me sirven el intercepto, b, y la pendiente, m. Para calcular la concentración de analito en la muestra, aplicamos la siguiente ecuación. Concentración de muestra va a ser igual a intercepto por concentración de estándar, dividido para pendiente por el volumen de muestra. En el ejemplo anterior sería la concentración de estándar, habíamos dicho 10 PPM y el volumen de muestra 5 ml. Las unidades en las cuales se expresa la concentración en este método van a ser las mismas unidades de concentración del estándar, ¿sí? En este caso serían PPM. En el trabajo que haremos en nuestro en nuestra clase mediante Zoom, vamos a realizar ejercicios para dejar más claro el tratamiento con estas técnicas. Yo les agradezco mucho su atención y nos estamos viendo en clase.
