[0:04]Soy Juan Antonio Llo Molina, profesor de Fundamentos Químicos de la Ingeniería en la Escuela Técnica Superior del Medio Rural y Enología. La presentación que voy a exponer trata acerca de algunos aspectos muy elementales de la espectroscopía de absorción ultravioleta visible. En primer lugar, trataremos de establecer el fundamento físico de esta técnica analítica. En segundo lugar, definiremos las principales magnitudes en que se basa el estudio, la aplicación cualitativa y cuantitativa de este método analítico. Y, por último, también se realizará una somera descripción del funcionamiento y de los elementos de un espectrofotómetro ultravioleta visible. La radiación ultravioleta visible corresponde a una zona relativamente pequeña del espectro electromagnético entre los rayos X y la radiación infrarroja. Cada tipo de radiación corresponde a transiciones energéticas determinadas, concretamente en el caso de la radiación ultravioleta visible. Los cambios energéticos correspondientes están asociados a transiciones entre niveles energéticos de los electrones de valencia de las moléculas, del mismo modo que, por ejemplo, los rayos X están relacionados con transiciones en los niveles energéticos de los electrones interiores y, por ejemplo, la radiación infrarroja y en las microondas, los niveles energéticos se corresponden a los distintos estados de vibración o rotación de las moléculas. Antes de fundamentar la espectroscopía ultravioleta visible como técnica analítica, conviene recordar qué es el color. El color de los cuerpos opacos está relacionado con la radiación que ese cuerpo refleja, un cuerpo, por ejemplo, que es azul, que lo vemos azul, es porque absorbe todas las radiaciones, menos la correspondiente a las longitudes de onda que nosotros percibimos como color azul, y ese es el color que asignamos a ese cuerpo. En el color por transmisión la situación es diferente, es decir, por ejemplo, en esta vidriera tan bella de la Catedral de León, cuando nosotros vemos el color azul, es porque ahí el vidrio es capaz de transmitir la radiación correspondiente a las longitudes de onda que nosotros percibimos como color azul, mientras que son absorbidas las radiaciones restantes. Aquí, por ejemplo, podemos observar cómo nosotros, si tenemos, por ejemplo, una disolución que percibimos de color verde, es porque absorbe toda la radiación, menos precisamente la correspondiente al color verde, que es la que se transmite y que, por tanto, somos capaces de percibir. En ello se basa, básicamente, el funcionamiento del espectrofotómetro ultravioleta visible. En él, lo que vamos a ver es que, descomponiendo la luz en todas las longitudes de onda desde la zona ultravioleta a la visible, veremos que hay distintos modos de trabajar con el espectrofotómetro. De esa manera, podremos estudiar para cada longitud de onda cuál es la absorción de radiación por parte de la disolución que estamos estudiando y, de ahí, podremos realizar un estudio cualitativo o cuantitativo. El cualitativo nos ayudará a identificar determinadas estructuras, la presencia de ciertos grupos funcionales o estructuras químicas, mientras que el enfoque cuantitativo nos permitirá obtener el valor de la concentración de una determinada sustancia en una disolución problema. El esquema básico de un espectrofotómetro ultravioleta visible es el siguiente: Partimos de una fuente de radiación, que en el caso de la radiación visible es una lámpara ordinaria de onfrramio, o en el caso de la radiación ultravioleta una lámpara de deuterio. La radiación emitida va a un monocromador. El monocromador puede ser un prisma o una red de difracción, la red de difracción se basa en el mismo principio, que el fenómeno que cotidianamente podemos observar cuando un disco compacto refleja la luz. Precisamente sobre la superficie del disco compacto se produce la interferencia luminosa de los rayos reflejados y las interferencias constructivas que van correspondiendo a cada radiación, a cada longitud de onda, es lo que nos hace percibir esa separación, esa dispersión de los colores del mismo modo que en un prisma.
[5:00]La radiación, una vez separada, en las radiaciones correspondientes a longitudes de onda diferentes, es lo que llevamos a cabo con el monocromador, eh, pasa a través de un sistema óptico, con un espejo, a un espejo semitransparente que divide el haz luminoso en dos haces. Uno pasa a través de una cubeta donde nosotros tenemos una disolución que contiene todo menos la sustancia que estamos tratando de determinar, y el otro haz que pasa a través de la cubeta que contiene la disolución problema. Precisamente a partir de la relación entre la intensidad luminosa que proviene de la cubeta de referencia y la radiación luminosa que proviene de la cubeta que contiene la disolución problema es como posteriormente definiremos el concepto de absorbancia que será la magnitud fundamental con que trabajaremos en este método analítico. En una disolución, en principio, ya que la especie que es responsable de la absorción de luz puede estar en mayor o menor concentración, es obvio que a mayor concentración, pues más radiación absorberá. Del mismo modo, también para una concentración determinada, cuanto mayor sea el espesor de disolución, el camino óptico, también se producirá una mayor absorción. Esas relaciones, que en principio son cualitativas, pueden cuantificarse y dar lugar a lo que llamamos Ley de Beer. Si tenemos una cubeta, por ejemplo, con una disolución que es de color magenta, como el permanganato de potasio, esa disolución va a absorber fundamentalmente la radiación correspondiente a la zona central del espectro visible, al color verde. Bien, pues la relación entre la intensidad de esa radiación que tiene una longitud de onda determinada y la intensidad de la radiación que sale, a partir de ahí podemos definir la transmitancia como el cociente entre ambas intensidades, habitualmente se expresa como tanto por ciento. A partir de ahí, por comodidad, se define la absorbancia como el logaritmo decimal de la inversa de la transmitancia. A partir de estas magnitudes, del camino óptico, de la concentración y de la absorbancia se expresa la Ley de Beer en la cual vemos que la absorbancia es proporcional al camino óptico, a la concentración, y también interviene una constante que es propia de la disolución, que es lo que denominamos absortividad molar del medio. Aquí, por ejemplo, podemos observar cómo hay distintas disoluciones con distinta concentración de permanganato de potasio, que tendrán, lógicamente, diferente absorbancia. Lo que se hace habitualmente es el camino óptico hacer que sea constante utilizando cubetas de un tamaño estándar. El espectro de absorción de una sustancia será, pues, la relación entre la absorbancia y la longitud de onda. Por ejemplo, en este caso, nosotros vemos esta disolución de color amarillo naranja, porque si observamos la variación de la absorbancia con la longitud de onda, para las longitudes de onda correspondientes a la zona azul violeta del espectro, la absorbancia es más grande. Precisamente será una disolución que al absorber en esta zona y transmitir en esta, nos dará el color correspondiente a la zona de menor absorbancia. Aquí, por ejemplo, tendríamos dos zonas de mayor absorbancia, una de menor, el color que observaremos será el de la zona de menor absorbancia, la zona donde se transmite una mayor intensidad de radiación. Como comentaba al principio, el espectro ultravioleta visible es característico de ciertas estructuras químicas y, en ese sentido, tiene también una aplicación cualitativa. Por ejemplo, el betacaroteno, una sustancia muy característica de muchas frutas y hortalizas, zanahorias, tomates, tiene lo que denominamos en química orgánica un sistema conjugado, que es una sucesión de enlaces simples y dobles a lo largo de la cadena carbonada. Esa estructura es capaz de dar lugar a absorción en la zona visible del espectro y, particularmente, absorbe en la zona azul violeta del espectro y transmite más en la zona amarillo naranja, que es precisamente el color que percibimos. En el caso de las disoluciones de dicromato de potasio y permanganato, el color de las disoluciones también lo podemos relacionar con la forma de la gráfica del espectro. Concretamente en el permanganato, tenemos una zona de máxima absorbancia que corresponde al amarillo verde y, precisamente, 525 nanómetros es la absorbancia máxima y es precisamente la longitud de onda que se va a adoptar para las mediciones cuantitativas. Esas mediciones cuantitativas se realizan preparando disoluciones patrón con concentración conocida y obteniendo lo que denominamos la curva de calibrado. Obteniendo la absorbancia con respecto a la concentración y ajustando por mínimos cuadrados la recta correspondiente, después para cualquier valor de la absorbancia de una disolución problema, podemos obtener fácilmente la concentración. Este es el fundamento de la aplicación cuantitativa de la espectroscopia de absorción ultravioleta visible. Así pues, en resumen, tenemos que las disoluciones pueden absorber con diferente intensidad la radiación ultravioleta visible según su longitud de onda de dicha radiación. Por este motivo, las disoluciones pueden ser coloreadas, es decir, si absorben en la zona visible del espectro, precisamente tendrán el color correspondiente a la zona de menor absorbancia, a la zona donde transmiten mejor la radiación. La forma del espectro, la gráfica, absorción, longitud de onda, está relacionada con la estructura molecular de los solutos correspondientes. Y, por último, si relacionamos la absorbancia a una determinada longitud de onda con la concentración, esa relación viene dada por la Ley de Beer, podemos determinar la concentración de una disolución problema para una determinada sustancia de interés.
